ROLA EGZOSOMÓW W PATOGENEZIE STWARDNIENIA ROZSIANEGO (SM), STWARDNIENIA BOCZNEGO ZANIKOWEGO (SLA) I INNYCH CHORÓB NEURODEGENERACYJNYCH.

Czas realizacji projektu: od: 01.01.2019 do: 31.12.2020
Opis projektu:

Egzosomy należą do małych pęcherzyków zewnętrzno-komórkowych, które mają pochodzenie endosomalne i występują w dużych ilościach w surowicy i innych płynach biologicznych. Wewnątrz egzosomów stwierdzono występowanie białek, lipidów, DNA, mRNA i mikroRNA. Uważa się, że egzosomy umożliwiają wymianę materiał biologicznego pomiędzy komórkami, w tym umożliwią komunikowanie się komórek na znaczna odległość, ponieważ mogą one przemieszczać się pomiędzy odległym częściami organizmu i pokonywać bariery biologiczne, np. barierę krew-mózg. Ze względu na małe wymiary (30-120 nm) i lipofilne właściwości egzosomy łączą się z wieloma komórkami i przekazują im transportowany materiał. Bardzo istotnym jest, że egzosomy nie zawierają przypadkowego materiału, ale ich cargo jest odzwierciedleniem stanu aktywności komórki związanego m.in. z procesem patologicznym w którym komórki te uczestniczą. Jak dotąd w literaturze naukowej skale są  dane na temat zmian i roli egzosomów w następstwie uszkodzenia mózgu w przebiegu chorób neurodegeneracyjnych.

Stwardnienie rozsiane (sclerosis multiplex- SM) jest przewlekłą autoimmunologiczną i neurodegeneracyjną chorobą ośrodkowego układu nerwowego (OUN), w przebiegu której dochodzi do zmian zapalnych, demielinizacyjnych, uszkodzenia oligodendrocytów, uszkodzenia aksonów oraz dysfunkcji bariery krew-mózg. Patofizjologia SM polega na generacji autoreaktywnych limfocytów w stosunku do składników mieliny a następnie atakowaniu i niszczeniu osłonek mielinowych otaczających aksony przez te limfocyty. Pomimo licznych badań, dokładne mechanizmy SM wciąż pozostają nie w pełni wyjaśnione. Niedawno udowodniono, że posttranskrypcyjne mechanizmy molekularne, w tym cząsteczki mikroRNA (miRNA) mogą wpływać na procesy immunologiczne i kontrolować odpowiedź immunologiczną. Pierwsze publikowane wyniki sugerują, iż mechanizmy zależne od miRNA mogą istotnie oddziaływać również na proces demielinizacji w OUN, co znacząco wpływa na kierunek dalszych badań w tej dziedzinie. miRNA mogą odgrywać kluczową rolę w modulowaniu funkcji układu immunologicznego oraz w regulacji funkcji komórek immunokompetentnych ze znaczącym wpływem na rozwój reakcji autoimmunologicznych. Ostatnie odkrycia wykazały, że miRNA istnieją także w przestrzeni zewnątrzkomórkowej, jako zawartość egzosomów. Okazuje się, że wewnątrz egzosomów, zlokalizowane są duże ilości cząsteczek miRNA. Taka lokalizacja miRNA powoduje, iż są one odseparowane od środowiska zewnątrzkomórkowego i znajdujących się tam enzymów zdolnych do degradacji RNA. Egzosomalne miRNA okazują się więc cechować się wyjątkową stabilnością. Stwarza to podstawy dla zupełnie nowego zjawiska– możliwości przekazywania i transport fragmentów transkryptomu z jednej komórki do drugiej. Znaczenie tego wyjątkowego fenomenu jest w dużej mierze nieznane.

W świetle ostatnio opublikowanych dowodów wskazujących na potencjalną rolę egzosomów i miRNA w regulacji układu immunologicznego i nerwowego, w niniejszym projekcie zostaną zbadane sekwencje i profile egzosomalnego miRNA obecnego w surowicy pacjentów chorych na SM, SLA i chorobę Alzheimera. SLA i choroba Alzheimera stanowią przykłady chorób neurodegeneracyjnych bez wyraźnego udziału komponenty immunologicznej. Stąd porównanie roli egzosomów i transportu między komórkowego pomiędzy chorobami neurodegeneracyjnymi o nieco innym podłożu molekularnych powinno dostarczyć ważnych danych na temat roli tych procesów w patologii neurodegeneracyjnej. W pierwszym etapie pracy zostanie pobrana krew od 10 pacjentów z rzutowo-remisyjną postacią SM, od 10 pacjentów z SLA i 10 z choroba Alzheimera. Grupa kontrolna będzie składać się z 10 zdrowych ochotników w podobnym wieku i rozkładzie płci jak grupy pacjentów. Określenia jakościowego i ilościowego profilu egzosomalnego RNA będzie dokonane przy pomocy techniki wysokoprzepustowego sekwencjonowania (next generation sequencing, NGS). Następnie wyniki sekwencjonowania NGS zostały poddane weryfikacji w drugiej grupie badanej tj. 20 pacjentów z SM, 20 z SLA i 20 z choroba Alzheimera.i przy pomocy techniki cyfrowej ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (digital PCR, dPCR).

Egzosomy zostaną wyizolowane z surowicy metodą immunoprecypitacji (polimer formulation method) przy pomocy zestawów ExoQuick (SBI System Bioscenses) liczba egzosomów i ich parametry morfologiczne zostaną określone w oparciu o analizę nanocząsteczek techniką Nanoparticle tracking analysis(NTA). Całkowite egzosomalne RNA zostanie wyizolowane za pomocą kitów SeraMir Exosome RNA (System Biosciences). Ilość oraz jakość wyizolowanego egzosomalne RNA zostanie ocenione za pomocą techniki Agilent i bioanalizatora (Agilent Technologies). Sekwencjonowanie techniką NGS zostanie wykonane zapomocą platformy HiSeq. Nastepnie zostanie dokonana analiza bioinformatyczna z wykorzystaniem dostępnych baz danych dotyczących różnych frakcji RNA takich jak: miRNA, tRNA, scaRNA, rRNA, piRNA, lincRNA, CDBox, HAcaBox, LINE, LTR, RefSeq eksony i introny. Wcześniejsza analiza w kierunku identyfikacji unikalnego profilu egzosomalnego miRNA ujawniła, iż w każdej z próbek egzosomów surowicy znajduje się od 350 do 400 różnych sekwencji miRNA. W ten sposób potwierdzone zostało, iż egzosomy są bogatym źródłem tych małych niekodujących RNA. W ramach drugiego etapu badań egzosomy zostaną wyizolowane z surowicy od niezależnej kohorty pacjentów. Wyniki tej drugiej, weryfikującej analizy, zostaną przeprowadzone za pomocą dPCR. Technika dPCR jest unikalna pod względem czułości i swoistości dla detekcji i oznaczania ilościowego zewnątrzkomórkowych RNA. W ramach dalsze analizy bioinformatycznej zostanie przeprowadzona analiza poszukiwawcza domniemanych wspólnych celów molekularnych dla zidentyfikowanych miRNA o zmienionej ekspresji w tych trzech chorobach neurodegeneracyjnych. Oczekiwane wyniki powinny doprowadzić do ujawnienia nowych informacji na temat zaburzenia molekularnej kontroli translacji w przebiegu trzech procesów chorobowych z udziałem neurodegeneracji i zaburzeń autoimmunologicznych. Wyniki powinny przyczynić się do oceny znaczenia transportu międzykomórkowego zależnego od egzosomów w rozwoju procesów neurodegeneracyjnych.

MOLEKULARNA OCENA ODLEGŁYCH ZMIAN PATOLOGICZNYCH PO PRZEBYTYM  USZKODZENIU OŚRODKOWEGO UKŁADU NERWOWEGO

grant NCBiR w ramach programu Era-Net Neuron Cofund

Czas realizacji projektu: koniec 2020

Akronim projektu: TRAINS

Partnerzy: 

CNRS‐ Université de Bordeaux, Institut des Neurosciences Cognitives d’Aquitaine (INCIA), Bordeaux, Francja University of Munich (LMU), Institute for Stroke and Dementia Research (ISD), Monachium, Niemcy Weizmann Institute of Science, Dep. of Neurobiol., Rehovot, Izrael UMR1141 Inserm‐Paris Diderot University, Robert Debré Hospital, Paryż, Francja Latvian Institute of Organic Syntheses, Ryga, Łotwa

Opis projektu:

Projekt TRAINS dotyczy badań nad mechanizmami odległego uszkodzenia mózgu (remote brain injury, remBI.) Uszkodzenia ośrodkowego układu nerwowego (OUN) uwarunkowane są złożonymi procesami patologicznymi , w których odgrywa rolę nie tylko dysfunkcja pierwotnie uszkodzonego miejsca, ale także zaburzenia odległych obszarów mózgu i rdzenia kręgowego, a nawet innych układów np. układu immunologicznego. Procesy prowadzące do rozwoju remBI pozostają nieznane. W naszej części projektu pragniemy poznać mechanizmy remBI poprzez analizę różnych modeli zwierzęcych uszkodzenia OUN. Badane modele będą obejmowały mechaniczne uszkodzenie mózgu (traumatic brain injury, TBI), oraz autoimmunologiczne ogniskowe zapalenie mózgu – doświadczalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE). Celem naszego projektu jest ocena roli egzosomów, jako mediatora sygnału uszkodzenia OUN, w rozwoju remBI. Egzosomy, małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe, występują w dużych ilościach w surowicy i innych płynach biologicznych. Zawierają białka, lipidy, a także kwasy nukleinowe, w tym przede wszystkim krótkie RNA. Egzosomy, wydzielane przez wszystkie typy komórek, mogą być następnie wchłaniane przez inne, odległe komórki. W ten sposób egzosomy mogą pełnić rolę przekaźnika informacji międzykomórkowej. W ramach naszego projektu ocenimy zmiany liczby krążących egzosomów, ich składu białkowego i profilu RNAa także interakcje egzosomów z komórkami immunologicznymi. Uważamy, iż egzosomy uwolnione w trakcie TBI i EAE mogą sprzyjać rozwojowi reakcji immunologicznych przeciwko antygenom OUN. Nasze badania będą dotyczyły analizy zmian w egzosomach w okresie do 6 miesięcy po uszkodzeniu OUN. W ramach naszych badań przeprowadzimy analizę proteonomiczną oraz analizę transkryptomu zawartego w egzosomach w trakcie TBI i EAE. Wyniki projektu powinny pomóc w lepszym zrozumieniu odległych reakcji na uszkodzenia mózgu.

PROFIL I FUNKCJA DŁUGICH NIEKODUJĄCYCH RNA W PRZEBIEGU AUTOIMMUNOLOGICZNEJ DEMIELINIZACJI

grant NCN w ramach programu OPUS

Czas realizacji projektu: od: 29.08.2017 do 28.08.2020
Opis projektu:

Stwardnienie rozsiane (łac. sclerosis multiplex - SM) jest jedną z najczęstszych i najbardziej okaleczających chorób układu nerwowego. Stanowi szczególnie duży problem, ponieważ dotyczy głównie ludzi młodych w wieku produkcyjnym, w pełni życia zawodowego i rodzinnego - początek zachorowania na SM występuje zwykle między 20 a 40 rokiem życia. SM pozostaje najczęstszą przyczyną nieurazowego inwalidztwa neurologicznego u ludzi młodych. Rozpowszechnienie SM wynosi około 1/1000 i dotyka w przybliżeniu 2,5 mln osób na świecie. Polska należy do krajów o wysokiej częstości występowania SM. Do niedawna medycyna miała bardzo niewielkie osiągnięcia na polu leczenia MS, nie dysponując lekami, które opóźniają jej rozwój. W ciągu ostatnich 20 lat nastąpił jednak ogromny postęp w tej dziedzinie. Wynika on z wprowadzenia nowych technik molekularnych do badania SM oraz poznania niektórych mechanizmów leżących u podstaw tej choroby. SM spowodowane jest przez atak własnego układu odpornościowego na oligodendrocyty. Oligodendrocyty tworzą mielinę, osłonę konieczna dla prawidłowego funkcjonowania komórek nerwowych. Pomimo poprawy w zakresie możliwości terapii SM, nadal możemy jedynie spowalniać przebieg choroby, i to za cenę ryzyka związanego z agresywnym leczeniem. Konieczne są więc dalsze badania, które umożliwią lepsze zrozumienie mechanizmów SM, a w efekcie wdrożenie zadowalającego leczenia. Limfocyty T typu pomocniczego (T CD4+, T helper cells, Th) są głównymi komórkami układu immunologicznego zdolnymi do rozpoznawania mieliny. Podtyp komórek Th – limfocyty Th17 jest odpowiedzialnymi za uszkodzenie mózgu w przebiegu choroby. Nie wszystkie komórki Th17 są jednak szkodliwe. Istnieje więc potrzeba dokładnych badań, aby można było odróżnić złe, powodujące chorobę (patogenne) od tych, które są potrzebne organizmowi (np. aby powstrzymywać infekcje, czy regulować stan drobnoustrojów jelitowych). Można także wykorzystywać naturalne mechanizmy regulatorowe – komórki Tr1, aby powstrzymywać patogenne Th17. Celem niniejszego projektu jest właśnie poznanie mechanizmów rozwoju i działania patogennych Th17, oraz ochronnych Tr1. Nasze dotychczasowe badania wykazały, iż nowe zdobycze biologii w dziedzinie epigenetyki, nauki o nieklasycznych mechanizmach genetycznych, mogą mieć fundamentalne znaczenie dla zrozumienia działania komórek Th17 i Tr1. Nasze badania dotyczące roli krótkich, niekodujących białek RNA, mikroRNA, przyczyniły się do odkrycia nowych, dotąd nieznanych mechanizmów rozwoju autoimmunologicznej demielinizacji. Pragniemy kontynuować nasze badania w zakresie roli niekodujących RNA, poprzez dogłębną analizę znaczenia długich, niekodujących RNA, lncRNA, dla rozwoju patogennych Th17 i ochronnych Tr1. W tym celu posłużymy się panelem badań genetycznych, molekularnych, bioinformatycznych i funkcjonalnych aby odkryć nowe mechanizmy rozwoju reakcji autoagresji przeciwko mielinie. Badania prowadzone będą z wykorzystaniem modelu zwierzęcego SM – doświadczalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE). Wykorzystanie tego modelu umożliwi nie tylko poznanie nowych mechanizmów rozwoju tego schorzenia, ale pozwoli na próbę zastosowania tej wiedzy celem powstrzymania bądź odwrócenia zmian patologicznych. Wierzymy więc, że nasz projekt przyczyni się do lepszego zrozumienia mechanizmów prowadzących do rozwoju SM, oraz pozwoli stworzyć nowe, lepsze, skuteczniejsze i bezpieczniejsze leki dla tej choroby.

ROLA KOLISTYCH RNA W AUTOIMMUNOLOGICZNEJ DEMIELINIZACJI

grant NCN w ramach programu PRELUDIUM

Czas realizacji projektu: od: 16.03.2016
Opis projektu:

Stwardnienie rozsiane (SM) jest ciężką, przewlekłą chorobą neurologiczną, która dotyka głównie ludzi młodych. Jest to choroba autoimmunologiczna przejawiająca się przewlekłym procesem zapalno-demielinizacyjnym układu nerwowego, w przebiegu której dochodzi do uszkodzenia istoty białej jak i szarej mózgu i rdzenia kręgowego. Etiologia choroby nie jest w pełni poznana, ale wiadomo, że mechanizmy jej rozwoju obejmują proces autoimmunologiczny skierowany przeciwko antygenom mielinowym. Uważa się, że SM jest chorobą wieloczynnikową. Obok czynników środowiskowych i podatności genetycznej w ostatnich latach skupiono uwagę rolę czynników epigenetycznych. Jednym z najbardziej znaczących odkryć w ostatnich latach w obszarze epigenetyki była identyfikacja grupy krótkich niekodujących cząsteczek RNA, zwanych mikroRNA (miRNA). Ich główna rola związana jest z potranskrypcyjną regulacją ekspresji licznych genów. Możliwa jest ona dzięki komplementarności par zasad z cząsteczkami informacyjnego RNA – w wyniku łączenia się cząsteczek miRNA z mRNA dochodzi do degradacji określonego RNA lub zahamowania translacji. Uważa się, że miRNA mogą odgrywać m.in. kluczową rolę w modulowaniu funkcji układu immunologicznego oraz w regulacji funkcji komórek immunokompetentnych. Zidentyfikowano wiele cząsteczek miRNA, które mają związek z SM, zarówno w komórkach OUN jak i w komórkach układu odpornościowego (m.in. miRNA-21, miRNA-146a/b, miRNA-155, miRNA-301a). Inne, niezwykle interesujące cząsteczki, od niedawna na nowo będące interesującym obiektem badań to koliste RNA (circular RNA, circRNA). Niedawne analizy wykazały obecność tysięcy endogennych circRNA. Sugeruje się, że niektóre z nich mogą regulować funkcję miRNA - nazywane są "naturalnymi gąbkami dla miRNA". CircRNA regulują ekspresję genów na poziomie transkrypcyjnym lub post-transkrypcyjnym przez interakcję z miRNA lub innymi cząsteczkami. Niektóre z kolistych RNA nich mogą kodować białka. 

Głównym celem projektu jest określenie potencjalnej roli circRNA w regulacji procesów immunologicznych w stwardnieniu rozsianym (SM), a także ocena potencjalnego wpływu kolistych RNA na regulację miRNA w patogenezie SM.